迈向前沿|RGD肽的发现之旅

怀怀

近期来自宾夕法尼亚大学的Jingya Qin等人设计了基于RGD肽的可电离脂质，配制成 LNP，用于整合素结合细胞和靶向mRNA递送，克服了LNP在某些应用中表现出有限的递送效率和组织特异性的问题（图1）。这种基于RGD的混合LNP系统是一个有前途的mRNA靶向递送平台，它可以以更有效和特定的方式进行基于mRNA的蛋白质替代和基因编辑，同时减少脱靶效应。



图1 基于RGD的脂质纳米颗粒 (RGD-LNP) 用于靶向 mRNA 递送。(a) RGD-LNP的制备 (b) RGD-LNP 有望与癌细胞表面的整合素受体相互作用。

该新型mRNA递送平台中使用的RGD肽是一种含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）短肽，是整合素与其配体蛋白相互作用的识别位点，介导细胞与胞外基质及细胞间的黏附作用，同时具有信号传导功能。RGD肽及其衍生物已经被广泛用作整合素的配体。RGD肽的发现为肿瘤靶向治疗、肿瘤分子影像诊断、心血管疾病、抗感染、mRNA 疗法等多种领域研究提供了一种新途径，而RGD肽这一伟大技术的发现主要归功于Erkki Ruoslahti教授及其团队。



图2 Erkki Ruoslahti教授

那么Erkki Ruoslahti教授是如何发现RGD肽呢？是像弗莱明一样偶然的发现青霉素，还是像克里克和沃森一样通过猜想发现了DNA双螺旋结构？接下来让我们一起阅读Erkki Ruoslahti 教授发现RGD肽的故事（以第一人称叙述）。
起源

1967年我在美国加州理工学院做博士后时，同事Roger Sperry 进行了大脑顶盖中视网膜轴突投射方面研究并得出必须有一个识别系统来引导生长的轴突到达顶盖的适当部分这一结论。当时的猜想是，负责引导的分子位于细胞表面，并且可能存在一个完整的识别系统来引导发育过程中和以后的细胞运动。Hood等人于1977年提出假设存在引导细胞定位的识别系统的Code假说，同时Dreyer 还提出Code可能是由永久性基因重排产生的，类似于在免疫系统中产生多样性的基因重排。因此我对Code假说产生了兴趣。那时我也已经对癌症感兴趣，如果说指导细胞运动和定位的识别系统真的存在，那么癌细胞一定有问题，因为癌细胞不遵循位置规则。我决定，在回到芬兰建立自己的实验室后将研究癌症中的区码分子。
纤连蛋白的发现

我和对类似的问题很感兴趣的Antti Vaheri一起着手分离可能介导细胞识别的细胞表面蛋白。当我们用不溶性木瓜蛋白酶处理从鸡胚胎成纤维细胞表面释放的蛋白质对兔子进行免疫时，突破来了。我们猜想通过免疫最终会产生针对各种细胞表面分子的抗体。免疫扩散和免疫电泳揭示了与细胞提取物中的抗体反应的单一抗原。Code假说认为任何参与区域代码类型细胞识别的蛋白质在恶性细胞中会被改变，因此我们测试了逆转录病毒转化的鸡胚成纤维细胞中是否存在这种蛋白质，很高兴地发现它并不存在。
我们对这些发现感到非常兴奋，并将蛋白质称为成纤维细胞表面的 SF 抗原。后来和Vaheri及 Deane Mosher 一起，决定将这种蛋白质命名为纤连蛋白，这个名字一直沿用至今。在接下来的几年里，我们研究了纤连蛋白在正常细胞和恶性细胞中的特性，以及作为细胞外基质蛋白的特性。我们还发现，纤连蛋白的血浆形式与称为“冷不溶性球蛋白”的蛋白质相同。曾经有一段时间，一些审稿人不允许我们将血浆蛋白称为纤连蛋白，它被称为冷溶球蛋白！根据我们的免疫化学结果，血浆形式和培养的成纤维细胞（通常称为“细胞纤连蛋白”）形成的形式之间没有明显差异，我们确信它们基本上是相同的蛋白质。
明胶亲和层析分离纤连蛋白

我们的下一个突破来自Eva Engvall，她发现纤连蛋白与变性胶原蛋白（明胶）结合要好得多。我们意识到我们可以利用纤连蛋白的明胶结合特性来分离蛋白质。我们主要使用血浆作为起始材料，因为它平均含有300 ug/ml的纤连蛋白，这使得分离大量蛋白质成为可能。我们在超市购买了明胶，将其与琼脂糖偶联，并在一个亲和层析步骤中纯化出纤连蛋白。
细胞附着促进活性的验证

Robert Klebe 和 Edward Pearlstein 表明固定在胶原蛋白上或直接固定在塑料上的纤维连接蛋白会介导细胞附着。这一发现是将纤连蛋白作为区号识别分子推进的一个巨大飞跃，我们为错过这个发现而自责，尽管已经看到一些迹象表明我们的抗纤连蛋白抗体导致了培养细胞的分离。
凭借轻松分离纤连蛋白的能力，我们开始研究分子的结构-功能关系，特别是胶原蛋白结合和细胞附着活性。我们收集了大量富含纤连蛋白的血浆冷沉淀物，用作明胶亲和层析的起始原料。最初对冷沉淀物中的纤连蛋白碎片化感到失望，但后来发现到碎片化模式非常规律，我们轻松地分离出几个单独的碎片（图3）。我们使用这些片段（推测来自纤溶酶裂解）来定位多肽 N 末端附近的胶原蛋白结合位点和中间的细胞附着位点，它需要 170 kDa 的片段长度来包含胶原蛋白结合位点和细胞附着位点。



图3 人血浆冷沉淀物中的纤连蛋白片段。(Lane 1) 血浆纤连蛋白 (lane 2) 200 kd片段 (lane 3) 170 kd片段 (lane 4) 100 kd片段。

然后我们继续制造更小的片段，这些片段在固定到塑料上时保留了促进细胞附着的活性。Michael Pierschbacher，一位拥有金手和超凡智慧的博士后研究员，制作了一种抑制纤连蛋白细胞附着活性的单克隆抗体，为分离比我们以前拥有的更小的活性片段提供了关键工具。纤连蛋白或其最大片段的胰凝乳蛋白酶消化产生了一个120 kDa片段，可强烈促进细胞附着， 但不与胶原蛋白结合。用胃蛋白酶对120 kDa片段进行进一步蛋白水解产生一个15 kDa 片段，该片段与抑制性抗体结合并促进细胞附着活性，尽管不如母片段强。
就在这时，我联系上了一位老朋友Per Peterson，他在瑞典乌普萨拉大学的实验室里建立了一套灵敏有效的蛋白质测序方法。Michael带着充足的 15 kDa 片段前往乌普萨拉。几个月后，Per Peterson对片段进行了完整的测序，它包含 108 个氨基酸残基（图4）。我们向 RGD 迈出了一大步。我预测我们很快就会有“合成纤连蛋白”，这是一种合成肽，可以复制纤连蛋白的细胞附着活性。结果证明这个预测是准确的。



图4 细胞附着域的氨基酸序列

有了手头的108个残基序列，我们现在可以转向合成肽。有一家公司为我们合成了四种肽，每种肽大约有30个残基长，覆盖了整个108个氨基酸序列，但有一些重叠。我用合成肽进行了细胞附着试验， 其中一种肽具有很强的细胞附着和扩散能力。我在笔记本上记录了结果，并认识到这一发现的商业潜力，让研究所所长见证了那一页并进行了公证。该笔记本此后一直存放在银行金库中。
RGD序列的探索

剩下的就很简单了。我们首先制作了活性肽的两半—一个是活性肽，我们又将它减半，很快就变成了四肽RGDS。接下来测试了具有四肽序列变异的肽，发现即使是RGD部分中最保守的取代（精氨酸(Arg)的赖氨酸、甘氨酸(Gly)的丙氨酸或D-丙氨酸和天冬氨酸(Asp)的谷氨酸）也与我们的细胞附着试验中的活性不相符。相反，第四个位置，纤连蛋白中的丝氨酸(S)可以变化，该位置的大多数（但不是所有）氨基酸都与RGD功能兼容。
我们猜想三肽（Arg-Gly-Asp，即RGD）负责纤连蛋白的细胞附着活性，也可能主导其他粘附蛋白的细胞附着活性。最初这个想法遭到了一些怀疑，KurtWutrich在巴塞尔的“我的谈话”后评论说，如果他实验室里有人声称三肽可以作为结合位点，他会解雇这个人。不过我并不担心，因为我们的数据非常好并且很快发表了一篇论文，证实了RGD在细胞附着中的重要性。
总结

Erkki Ruoslahti 团队先是发现了纤连蛋白，随后在纤连蛋白中发现了 RGD 细胞附着序列，并分离出RGD定向细胞受体，现在称为整合素。RGD肽及整合素的发现大大促进了癌症等疾病的新型药物开发，或许RGD肽成为肿瘤靶向疗法下一个风向标。让我们一起期待未来RGD肽更多的应用，科学探索永无止境！
参考文献

[1] Jingya Qin, et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Adv. 2022 Sep 7;12(39):25397-25404.
[2] M D Pierschbacher, et al. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 1981 Oct;26(2 Pt 2):259-67.
[3] M D Pierschbacher, et al. The cell attachment domain of fibronectin. Determination of the primary structure. Biol Chem. 1982 Aug 25;257(16):9593-7.
[4] Erkki Ruoslahti. The RGD story: a personal account. Matrix Biol. 2003 Nov;22(6):459-65.